5

Современные представления о механизме канце-
рогенеза связаны с признанием существования опу-
холевых стволовых клеток (ОСК) – клеток, которым
пр
инадлежит ключевая роль в инициации и развитии
опухолевого процесса [1]. В сόлидных опухолях ОСК
впервые были обнаружены M. Al-Hajj и соавторами,
которые показали, что только небольшая популя
-
ция клеток с фенотипом CD44
+
CD24
-/low
ESA
+
(ESA
epithelial-specic antigen – специфический для эпите-
лиальных клеток антиген) способна индуцировать
р
азвитие опухолей при их трансплантации иммуноде-
фицитным мышам [2]. Впоследствии бы
ли накоплены
убедительные доказательства присутствия ОСК в раз-
личных типах сόлидных опухолей человека [3].
О
СК обладают устойчивостью к действию повреж-
дающих факторов. Они характеризуются высокой ре-
зистентностью к химиотерапевтическим препаратам,
б
лагодаря высокому уровню экспрессии генов АВС-
транспортеров ABCG2, ABCB1 и АВСС1, которые обе
-
спечивают выброс цитотоксических лекарств из кле-
ток [4].
О
СК также обладают устойчивостью к действию
ионизирующего излучения, благодаря высокой актив
-
ности систем репарации ДНК, высокому уровню анти-
оксидантов, повышенной экспрессии генов, обеспе-
чивающих биосинтез глутатиона, и высокому уровню
а
нтиапоптотических белков. Помимо указанных био-
химических особенностей, радиоустойчивость ОСК
о
пределяется их локализацией в опухоли. Известно,
что в опухоли ОСК занимают определенные ниши и
особенно часто встречаются в гипоксических зонах. В
этих условиях опухолевые клетки синтезируют инду
-
цируемый гипоксией фактор (HIF– hypoxia-inducible
fac
tor), который активирует транскрипцию генов,
кодирующих белки сигнальных путей Notch, Wnt и
Hedgehog. Эти пути играют важную роль в регуляции
пролиферации ОСК. Их активация приводит к уско
-
ренной репопуляции ОСК во время или после лучевой
т
ерапии [5].
Несмотря на несомненные успехи современной
радио- и химиотерапии в лечении онкологических за
-
болеваний, у многих пациентов случаются рецидивы
з
аболевания или развиваются отдаленные метастазы.
Риск рецидивирования онкологического заболевания
после лечения во многом зависит от сохранения ОСК,
резистентных к химическому, лучевому или комбини
-
рованному воздействию [5].
Р
езультаты исследований, выполненных in vitro
и in vivo, свидетельствуют о том, что ОСК обладают
устойчивостью и к фракционированному облучению.
Известно несколько механизмов такой устойчивости,
включая повышенную способность к репарации субле
-
тальных повреждений в промежутках между сеанса-
ми облучения [6]. Показано, что фракционированное
.. , .. , .. , .. 
    
    MCF7   
Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт», Москва. E-mail: shuvatova.vg@gmail.com
В.Г. Шуватова – инженер-исследователь; А.П. Кувырченкова – лаборант-исследователь; Ю.П. Семочкина – лаборант-исследователь;
Е.Ю. Москалёва – в.н.с., д.б.н., проф.

Цель: Изучить влияние никлозамида на радиочувствительность опухолевых стволовых клеток (ОСК) аденокарциномы молочной железы
человека линии MCF-7 и исследовать механизм его радиосенсибилизирующего действия.
Материал и методы: 3D-культуру маммосфер линии MCF-7 получали при культивировании прикрепляющихся клеток 2D-культуры в низ-
коадгезивных условиях в среде, содержащей EGF, bFGF, добавку В27, гепарин и инсулин. Через 7 и 14 сут после гамма-облучения клеток 2D- и
3D-культур в виде суспензии в дозах 1, 2, 4, 6 и 8Гр (
60
Co) исследовали размер фракции ОСК с фенотипом CD44
+
/CD24
-/low
с помощью проточной
цитометрии. Влияние никлозамида на радиочувствительность клеток 2D- и 3D-культур оценивали с помощью подсчета их количества в камере
Горяева через 7 и 14 сут после облучения в дозах 2 или 4Гр. Никлозамид добавляли к клеткам за 1 ч до облучения в концентрации 2 мкМ. Через
7 сут после совместного действия облучения и никлозамида исследовали размер фракции ОСК. Через 1 ч после облучения определяли уровень
гистона γH2AX с помощью проточной цитометрии.
Результаты: Культивирование клеток линии MCF-7 в виде маммосфер приводит к увеличению содержания ОСК: доля ОСК в 2D-культуре
составила 0,2± 0,1%, а в 3D-культуре – 3,2± 0,6%. При облучении размер фракции ОСК увеличивался пропорционально дозе. Через 14 сут по-
сле облучения в дозе 8Гр он достиг 2,2± 0,6% в 2D-культуре и 12,0± 0,9% в 3D-культуре. Обнаружена более высокая радиоустойчивость клеток
линии MCF-7, культивируемых в виде маммосфер. Через 7 и 14 сут после облучения в дозе 2Гр количество клеток 2D-культуры снижалось до 58±
4% и 43± 7%, а клеток 3D-культуры – до 92± 13% и 66± 11% соответственно по сравнению с контролем. Через 7 и 14 сут после облучения клеток
в дозах 2 и 4Гр при их инкубации с никлозамидом обнаружено статистически значимое (р<0,05) снижение количества клеток по сравнению с
их количеством после облучения в соответствующих дозах без добавления никлозамида. Через 7 сут после облучения в дозах 2 и 4Гр доля ОСК в
культуре маммосфер составила 6,0± 0,6% и 3,0± 0,8%, а после инкубации с никлозамидом и облучения – 4,0± 0,1% и 2,5± 0,3% соответствен-
но. В клетках 3D-культуры уровень гистона γH2AX через 1 ч после облучения в дозах 2 и 4Гр увеличился в 2,4 и 4,8 раз относительно исходного
уровня, а после совместного действия никлозамида и облучения в этих же дозах – в 3,4 и 5,5 раз, что свидетельствует об увеличении двунитевых
разрывов ДНК в этих условиях.
Выводы: Никлозамид обладает радиосенсибилизирующим действием в отношении ОСК аденокарциномы молочной железы человека линии
MCF-7, культивируемых в виде 2D и 3D-культур, увеличивая уровень пострадиационных повреждений ДНК.
 : никлозамид, γ-излучение, линия MCF-7, опухолевые стволовые клетки, аденокарцинома молочной железы человека, радио-
устойчивость, радиосенсибилизация
Поступила: 29.11.2016. Принята к публикации: 09.11.2017
Медицинская радиология и радиационная безопасность. 2017. Том 62. №6 Радиационная биология
DOI 10.12737/article_5a251c065ed543.22688556
6
Радиационная биология Медицинская радиология и радиационная безопасность. 2017. Том 62. №6
облучение приводит к увеличению относительного и
абсолютного количества ОСК, которые способны вос-
станавливать основную популяцию клеток, благодаря
сп
особности ОСК к пролиферации и дифференци-
ровке в обычные опухолевые клетки, не обладающие
св
ойствами стволовых. Так, обнаружено увеличение
доли клеток с фенотипом CD133
+
, характерным для
ОСК, после фракционированного облучения (5×3Гр)
ксенотрансплантатов глиомы in vivo и увеличение
ОСК карциномы молочной железы линии T-47D и
аденокарциномы молочной железы линии MCF-7 по
-
сле фракционированного облучения (4×3Гр и 5×3Гр)
[7]. Обн
аружено, что фракционированное облучение
усиливает пролиферацию ОСК, индуцируя их вы
-
ход из фазы G
0
и переход в стадию пролиферации [8].
Показано, что в опухолях некоторых типов количество
ОСК коррелирует с клиническим исходом лучевой те
-
рапии [9].
Для пр
еодоления высокой устойчивости ОСК к
действию излучения необходим поиск новых способов
лучевой терапии, в том числе с использованием радио
-
сенсибилизаторов [10].
Р
езультаты исследований, выполненных в послед-
ние годы, свидетельствуют о том, что ОСК особенно
ч
увствительны к повреждению митохондрий [11].
Высокая активность в отношении ОСК обнаружена
у хорошо известного и давно используемого в прак
-
тике противогельминтного препарата никлозамида,
м
еханизм действия которого связан с повреждением
митохондрий и снижением образования АТФ путем
окислительного фосфорилирования. Было показано,
что он может повышать чувствительность к облуче
-
нию клеток рака легкого, культивируемых in vitro [12].
Ц
елью настоящей работы явилось изучение спо-
собности никлозамида сенсибилизировать ОСК
а
денокарциномы молочной железы человека линии
MCF-7 к действию γ-излучения, оцениваемой по его
влиянию на количество клеток и образование двуни
-
тевых разрывов (ДР) ДНК, определяемых по уровню
ги
стона γН2АХ.
Известно, что содержание ОСК в культуре кле
-
ток линии MCF-7 невелико, но может быть увеличе-
но при их культивировании в специально разрабо-
танных условиях в суспензионной культуре в виде
с
фероидов – маммосфер. Поэтому в работе исполь-
зовали два способа культивирования клеток: в виде
2D
-культуры – культуры прикрепляющихся к пла-
стиковой подложке клеток и в виде суспензионной
3D
-культуры маммосфер.
  
Культивирование клеток
Клетки аденокарциномы молочной железы челове-
ка линии MCF-7 (2D
-культура) культивировали в среде
DMEM (Gibco, США), с добавлением 10% фетальной
бычьей сыворотки (ФБС) (HyClone, США) и 50 мкг/мл
гентамицина (HyClone, США) в СО
2
-инкубаторе при
37 °С в увлажненной атмосфере (95 %), содержащей
5% СО
2
.
Культуру маммосфер в соответствии с протоко-
лом получали из клеток 2D
-культуры согласно рабо-
те [13] с некоторыми модификациями. После дости-
жения 80 %-й конфлюэнтности клетки 2D
-культуры
линии MCF-7 снимали с подложки с помощью 0,05%
раствора трипсина в растворе Версена и помещали в
низкоадгезивные культуральные чашки в концентра
-
ции 20 клеток/мкл в среде DMEM/F12 без фенолово-
го красного (Gibco, США), содержащей 20 нг/мл EGF
(C
albiochem, Германия), 10 нг/мл bFGF (PeproTech,
США), 2 % специальной добавки B27 (Gibco, США),
10 мкг/мл инсулина (Calbiochem, Германия), 4 мкг/мл
гепарина (Serva, Германия), 50 мкг/мл гентамици-
на (HyClone, США). Через 5–7 сут культивирования
ф
ормировались маммосферы диаметром 100–150 нм.
Их собирали при помощи центрифугирования (100g,
5мин) и диссоциировали раствором аккутазы (Sigma-
Aldrich, Германия) на отдельные клетки, которые куль
-
тивировали в указанных условиях.
П
одсчет количества клеток
Клетки 2D-культуры снимали с подложки с помо-
щью 0,05% раствора трипсина в растворе Версена, а
м
аммосферы диссоциировали с помощью раствора ак-
кутазы. Клетки суспендировали в культуральной среде
и
количество живых клеток 2D- и 3D-культур подсчи-
тывали в камере Горяева с использованием трипаново-
го синего для исключения мертвых клеток.
О
блучение клеток
Клетки 2D- и 3D-культур облучали в виде суспен-
зии в 2 мл бессывороточной среды DMEM или среды
D
MEM/F12 без факторов и добавок соответственно в
концентрации 45 тыс. клеток/мл в дозах 1, 2, 4, 6 и 8Гр
на установке ГУТ-200М (источник γ-излучения
60
Co,
мощность дозы 0,54Гр/мин). После облучения клетки
переносили в соответствующую полную среду и куль
-
тивировали в стандартных условиях в течение 7 или
14
сут, после чего проводили подсчет клеток и опреде-
ляли размер фракции ОСК.
А
нализ количества клеток 2D‑ и 3D‑культуры
при совместном действии γ‑излучения и
никлозамида
Влияние совместного действия γ-излучения и
никлозамида на количество клеток 2D и 3D-культур
оценивали через 7 и 14 сут после облучения. За 1 ч
до облучения клетки диссоциировали, к части образ
-
цов добавляли никлозамид в концентрации 2 мкМ,
з
атем клетки с никлозамидом и без него облучали в
дозах 2 и 4Гр, после чего суспензию клеток помеща
-
ли в 6-луночные планшеты (низкоадгезивные для
3D
-культуры) по 44 тыс. клеток в лунку в соответ-
ствующей полной культуральной среде, содержащей 2
мкМ ник
лозамида. Через 24 ч после облучения среду,
содержащую никлозамид, заменяли на среду без этого
препарата. Контрольные и облученные маммосферы
рассевали в концентрации 20 клеток/мкл 1 раз в 7сут.
Прикрепляющиеся клетки пересевали 1 раз в 7 сут,
так как исходно их специально высаживали в низкой
7
Медицинская радиология и радиационная безопасность. 2017. Том 62. №6 Радиационная биология
плотности. При этом необлученный контроль– необ-
лученные образцы с добавлением никлозамида– рас-
севали в соотношении 1 : 3, а клетки, облученные в
д
озе 2Гр и 2Гр с добавлением никлозамида,– в соотно-
шении 1:2. Указанные условия использованы для того,
ч
тобы после пересева клетки во всех культурах были в
одинаковой плотности. Клетки, облученные в дозах 4,
6, 8Гр и 4Гр с добавлением никлозамида, не рассева-
ли, так как они росли медленно. Через 7 и 14 сут после
о
блучения количество живых клеток подсчитывали в
камере Горяева с использованием трипанового синего
для выявления погибших клеток. После подсчета ко-
личества клеток в контрольных необлученных куль-
турах (0Гр) через 14 сут культивирования рассчиты-
вали общее количество клеток, которое должно было
выр
асти в культуре с учетом разведения при пересеве.
Аналогичным образом определяли общее количество
клеток в необлученных образцах с добавлением никло-
замида, а также в культурах, облученных в дозе 2Гр и
2
Гр с добавлением никлозамида. Подсчитанное коли-
чество клеток в контрольных необлученных культурах
(0
Гр) через 7 и 14 сут культивирования было принято
за 100 % для соответствующих временных точек при
культивировании клеток после разных воздействий.
Проведено 2 эксперимента.
Определение фракции опухолевых стволовых
клеток
Фенотипирование клеток 2D- и 3D- культур по
антигенам CD24 и СD44 проводили в соответствии с
[14]. Клетки диссоциировали как описано выше, со
-
бирали с помощью центрифугирования, осадок кле-
ток промывали холодным буфером для окрашивания,
с
остоящим из фосфатно-солевого буфера, 0,1% азида
натрия (Merck, Германия) и 0,1% бычьего сывороточ-
ного альбумина (ДИА-М, Россия) и ресуспендировали
в т
ом же буфере. К 50 мкл суспензии клеток добавляли
по 2,5 мкл антител к CD24, меченных флуоресцеини-
зотиоцианатом (FITC), и антител к CD44, меченных
ф
икоэритрином (PE, оба антитела Biolegend, США).
Клетки инкубировали с антителами в темноте, при
+4°С в течение 45 мин, затем трижды промывали хо-
лодным буфером для окрашивания и определяли долю
к
леток с фенотипом CD44
+
/CD24
-/low
, анализируя су-
спензию клеток на цитофлуориметре FacsCalibur (BD
B
ioscience, США, ресурсный центр молекулярной и
клеточной биологии).
Анализ содержания гистона γН2АХ c помощью
проточной цитофлуориметрии
После облучения в дозах 2 и 4Гр с добавлением и
без добавления никлозамида клетки 2D- и 3D-культур
инкубировали в культуральной среде в течение 1 ч
при 37
о
С, затем проводили анализ, как описано в [15]
с некоторыми модификациями. Клетки промывали
фосфатно-солевым буфером (ФСБ) c 3% ФБС и фик-
сировали в абсолютном метаноле при +4 °С в течение
20 мин, о
бразцы хранили в метаноле при –20 °С до
проведения измерений. Перед исследованием клет-
ки отмывали от метанола в растворе для блокировки
СБ, содержащий 3% ФБС и 0,05% Твин-20; pH 7,4)
и инкубировали в этом растворе с прямыми мышины
-
ми моноклональными антителами к гистону γH2AX,
м
еченными Alexa Fluor 488 (BD Pharmingen, США;
разведение 1:100). Для измерения использовали не ме-
нее 100 тыс. клеток на пробу в виде суспензии в ФСБ.
Ан
ализ проводили на проточном цитофлуориметре
FacsCalibur.
Статистические методы
Статистическую обработку результатов проводи-
ли по методу Стьюдента с использованием программы
Or
iginPro 8.1. Различия считали статистически значи-
мыми при р<0,05.
  
Размер фракции ОСК – клеток с фенотипом
CD44
+
/CD24
-/low
– в 2D- и 3D-культурах анализиро-
вали в контрольных и облученных клетках через 7 и
14
сут после действия γ-излучения. Полученные ре-
зультаты представлены на рис. 1. На рис.1А показан
пр
имер результатов анализа субпопуляции CD44
+
/
CD24
/low
методом проточной цитофлуориметрии. В
2D-культурах контрольных клеток фракция ОСК со-
ставила в среднем 0,2± 0,1% от общей популяции, а в
3D
-культурах– 3,2± 0,6%. Таким образом, содержание
ОСК в 3D-культурах линии MCF-7 было в среднем в
16раз выше, чем в 2D-культурах.
Из данных, представленных на рис. 1Б и 1В, сле
-
дует, что облучение приводит к зависящему от дозы и
вр
емени после воздействия увеличению фракции ОСК
в культуре клеток линии МCF-7. Так, в 2D-культуре
при дозе 8Гр, а в 3D-культуре, начиная с дозы 2Гр, об
-
наружено увеличение доли этих клеток через 7 сут по-
сле воздействия. Через 14 сут после облучения размер
фр
акции клеток CD44
+
/CD24
-/low
увеличивался как в
2D-, так и в 3D-культурах клеток пропорционально
дозе, начиная с дозы 4Гр. Через 7 сут после облучения
в дозе 8 Гр доля ОСК в 2D-культуре составила 1,5 ±
0,2%, а в 3D-культуре– 6,0± 0,4%, а на 14 сут– со
-
ответственно 2,2± 0,6 и 12,0± 0,9%. Подчеркнем, что
пр
и длительном культивировании общее количество
контрольных клеток и клеток после различных воз
-
действий подсчитывали с учетом их разведения при
п
ересеве, как описано в разделе «Материал и мето-
ды». Полученные результаты соответствуют пред-
ставлениям о высокой устойчивости ОСК к действию
γ-изл
учения, которая, как известно, в значительной
мере определяется высоким уровнем репарации ДНК
в этих клетках [16].
В следующей серии экспериментов было изуче
-
но влияние облучения, никлозамида и совместного
д
ействия этих факторов на количество клеток линии
MCF-7, культивируемых в виде 2D- и 3D-культур.
Данные, представленные на рис. 2, свидетельствуют
о более высокой устойчивости клеток 3D-культуры к
действию облучения. Облучение в дозах 2 и 4Гр при
-
водило к снижению количества клеток 2D
-культуры